治疗诊断应用：掺入金纳米颗粒保护壳，提高油壳微泡的结构稳定性

文|时梦嫣

编辑|时梦嫣

前言

癌症是美国第二大死因，根据美国癌症协会的数据，仅在2022年就可能发现190万新发癌症患者，预计美国将有近609360例癌症相关死亡。

化疗是单独使用或与另一种治疗方法结合使用的主要治疗方法之一，具体取决于疾病的类型和阶段。

化疗药物主要通过静脉和口服途径给药，由于缺乏特异性、耐药性和健康组织中的高毒性，限制了该方法的有效性和安全性。

有研究报道了严重的不良反应，近十年来人们为了实现，能够减轻化疗不良反应的替代创新疗法，做出了大量的努力。其中靶向和触发释放药物递送方法，引起了许多研究人员的关注。

该方法的目标是将活性剂封装在保护性载体内，以最大程度地减少健康组织对药物的暴露，并且仅在特定的肿瘤部位释放药物。

当前相关专家已经研究了基于机械和热的触发释放机制，例如超声波和激光。

现阶段研究人员关注的重点是，如何通过掺入金纳米颗粒保护壳，来提高油壳微泡的结构稳定性？如何用于治疗诊断实操？

磷脂制剂

脂质混合物的制备方式与赛格斯等人相似，将二棕榈酰磷脂酰胆碱、叠氮磷酸二苯酯、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇5000脂质粉末，以80：10：10的摩尔重量比溶解在氯仿中。

对于荧光研究还向脂质混合物中，每毫升加入0.05毫克的苯恶二唑二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

然后将混合物在温和的氮气流下，在玻璃小瓶壁上干燥，将含有脂质膜的小瓶置于真空中过夜以完全干燥，第二天将脂质重新悬浮在磷酸缓冲盐溶液中，总脂质浓度为每毫升5毫克。

为了确保不同组之间的气体饱和度相似，伺服将根据脱气程序改变阀门位置，从而允许气体饱和过程中涉及的多个脱气和气体注入循环。

实验设置和气泡产生

油酸用于在微气泡周围形成油壳，对于荧光研究，将亲脂性荧光探针尼罗红以每毫升1微升的浓度添加到油相中，以可视化和研究油层，将油和脂质溶液分别装入装有23号针头的注射器中以适合管道。

使用数字控制注射泵以恒定流速输送到微流体装置，八氟环丁烷直接从连接到主调压器的加压罐，供应到定制的二级调压阀。

该二级调节器用于控制微流体通道内的气体压力，二级调节器的出口连接到柔性塑料微孔管，该管放置在微流体气体入口内以输送气相。

气泡产生稳定后，将微气泡收集到2毫升螺旋盖小瓶中，其顶部空间充满八氟环丁烷气体，并含有1毫升的八氟环丁烷饱和脂质溶液。

映像设置

用尼康倒置显微镜监测微气泡的产生，并由幻影高速相机捕获高速图像，然后将这些图像用于对微流控芯片内的微气泡进行统计分析。

对于微气泡的后期生产成像，将10微升气泡加载到伯爵夫人载玻片上，并放置在奥林巴斯倒置显微镜上，然后使用连接到显微镜的相机捕获荧光和明场图像。

统计分析流水线使用专业的软件开发了自动化图像分析管道，根据微气泡的独特特征识别微气泡。该算法将测量和报告气泡统计属性，例如它们的直径、分布和多分散指数。

荧光强度测量

使用科学图像处理工具测量沿特定感兴趣区域的荧光强度，首先将图像加载到处理工具中，然后使用内置的投资回报率工具绘制感兴趣区域。

在调整背景并降低噪声后，沿着投资回报率测量了荧光信号，测量数据保存在CSV文件中，然后导入到Python中，以沿投资回报率线绘制强度。通过使用这些步骤，能够准确测量和分析图像中感兴趣区域的荧光强度。

磷脂壳DEB的形态和稳定性

研究中展示了微流体装置内DEB的生产，为了检查DEB的形态和分布，从流动聚焦装置的出口收集样品并加载到载玻片上，然后在显微镜下观察，油层的存在通过明场和荧光成像得到证明。

与观察气芯周围的均匀油壳相反，在DEB的表面上观察到了油滴。

研究中显示：a是用于生成DEB的FF装置的示意，b是片外去湿及其特性的示意，c是DEB生产过程中微流体装置的快照，d是微气泡的片外去湿。

这种现象以前曾被研究人员观察到，并将其归因于壳中多余的油，在DEB壳上形成的油珠，在这个研究中，研究人员没有报告这些微气泡形态的演变或其稳定性。

目前研究的结果表明，微气泡外壳上油珠的形成是由于脱湿过程的开始，换句话说DEB形态在生成后的几分钟内从完全吞噬状态转变为部分吞噬状态，在许多液体系中都观察到这种现象。

脱湿是一种动态现象，在水包油包水的液体中，如果完全吞噬和部分吞噬构型在热力学上不稳定，则体系逐渐向非吞噬状态移动并形成两个独立的液滴。

这种方法经常用于使用水包油包水液模板，制备高度受控的囊泡和人造膜，用于药物递送等应用。

由于本工作提出的三相体系由气芯组成，其他现象如奥斯特瓦尔德成熟和气体溶解也影响了水包油包水液的稳定性和构型。

先前对用脂质膜稳定的单层微泡的研究，已经确定脂质膜堆积密度在稳定和单分散的MB群体的形成中起着至关重要的作用。

根据这些研究，新形成的MB群的脂质壳结构，将处于低堆积密度的无序状态。

由于拉普拉斯超压导致MB群继续溶解，脂质膜被压缩，这个过程一直持续到达到气泡的终端尺寸，此时MB机械压缩产生的表面压力被表面张力平衡。

微气泡的压缩增加了界面处的脂质堆积密度，为气体分子在MB外的扩散创造了屏障，从而进一步稳定了种群。

在研究中提出的DEB中，假设油壳脱湿的自发开始将形成一个前进的油滴，该油滴将进一步拉伸单层，从而禁止形成完全冷凝的脂质单层，该脂质单层可以作为气体分子的有效扩散屏障。

DEBs更容易受到气体溶解和奥斯特瓦尔德成熟的影响，从而影响种群的单分散性和稳定性，为了补偿这种效应，需要更多的脂质分子在界面处被吸收，并且考虑到静止的环境，这个过程将受到限制。

值得注意的是由于气泡具有浮力，并且紧密地堆积在储存瓶的顶部，而脂质分子驻留在水介质内，因此扩散进一步受到阻碍。

研究显示了不同脂质配方在10、20和30分钟后，产生的双层微泡的形态，白色实心圆圈表示去湿的微气泡，白色虚线圆圈表示微气泡之间的毛细管桥形成，黄色实心圆圈表示有去湿油滴的区域，黄色虚线圆圈表示富含FA的微区，比例尺为25微米。

对DEB荧光图像的进一步检查，突出了MB壳外围存在石油残留物，一些研究报告了脂肪酸混溶于脂质膜中。

特别是古尼阿弯等人，研究了油酸与二棕榈酰磷脂酰胆碱膜的相互作用，并表明油酸确实混溶于这种类型的膜中，并且在掺入时此膜的刚度降低。

鉴于研究中DEBs周围的脂质单层，富含二棕榈酰磷脂酰胆碱，富油酸微域的形成归因于单层内油酸的混溶性。

据推测这些微域产生了缺陷区域，并破坏了脂质膜的有序结构，增加了其横向扩散率和渗透性，从而促进了气体溶解。

这进一步支持了的假设，即研究中提出的DEB周围的脂质膜，不会达到封闭包装状态，此外这些富含FA的微结构域也可以在DEB中形成突起。

从而产生类似于覆盆子状乳液体系的形态特征，DEB表面的油性突起可能进一步导致气泡聚结和溶解，当两个或多个油滴彼此靠近时，它们仅由连续相的薄膜隔开。

一旦该膜破裂，两个油滴合并在一起并形成更大的油滴，以达到最低的拉普拉斯压力。这在其他分离的微气泡之间形成了毛细管桥，并不断缩短DEB之间的距离，从而增加了它们聚结的可能性。

研究显示的白色虚线圆圈突出了三个相邻DEB之间毛细管桥的形成，在其他覆盆子状油水油乳液系统中，也观察到相邻液滴之间的毛细管桥形成。

如果在相似大小的DEB之间形成毛细管桥，则可能导致DEB的直接聚结，然而如果在具有大直径比的气泡之间形成毛细管桥，奥斯特瓦尔德成熟将成为主导机制，这涉及气体分子从较小的气泡扩散到较大的气泡。

由于当前系统中的DEBs密集，推测直接聚结和奥斯特瓦尔德成熟，可以共存并相互加强，从而导致一连串的聚结事件。

研究显示了微气泡随时间变化的无量纲平均直径，可以看出随着时间的推移，总体均值只会增加，这进一步支持了级联聚结事件的发生，导致微气泡的丧失及其种群单分散性。

研究中的实心形状表示平均值，误差条表示样本的标准偏差。尽管研究表明脂质浓度的增加，降低了微气泡的生长速率，但这些结构的形态学研究表明脂质浓度的增加倾向于加速脱湿过程。

去湿油滴的数量是评估去湿过程的重要指标，可是准确确定这个数字是一项具有挑战性的任务。

传统的圆形物体检测算法无法区分去湿油滴和仍然附着在微气泡壳上的油滴，因此开发了一种机器学习辅助的分割方法，即以自动检测去湿油滴。

研究结果显示了各种磷脂配方的去湿油滴总数，将磷脂浓度从每毫升1.19毫克提高到每毫升1.56毫克或每毫升2.45毫克，使去湿油滴总数分别增加1.5%和3%。

与单乳微泡相反，增加磷脂的浓度并不会导致更稳定的微泡构型。

结论

研究提出了一种简单的方法，使用分散指数小于3%的微流控装置，实现微泡的一步稳定生产，并且使用显微镜和机器学习辅助分割所得图像，对DEB的微观结构进行了表征。

分析表明脂壳DEBs存在严重的去湿不稳定性，容易形成覆盆子状结构，使其作为药物递送囊泡效率低下。

GNPs的加入可以显著延缓，去湿不稳定性的发生和进展，并通过改变表面能和提供空间位阻屏障来稳定DEB结构。

研究中只考虑了5纳米GNP，预计不同尺寸、组成和几何形状的纳米颗粒，可用于DEBs外壳，以产生用于治疗诊断应用的多功能和多模态造影剂。

研究介绍的GNP和DEB，可用于超声引导的光热疗法、光声引导的超声介导的药物递送等应用。

虽然研究中提出的微泡的大小，对于体内应用来说很大，但它们是体外治疗诊断学研究的绝佳候选者，特别是用于评估治疗药物，对细胞或组织模型的递送及其相关的生物学效应。

未来的工作将解决具有临床相关大小的DEB的产生，FF微流体装置的简单性使其易于扩大规模，调整DEB的大小，并生产定制设计的DEB用于患者床边的药物输送。

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