深海宏基因组研究下，对深海微生物群落代谢结构的深入了解

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引言

深海驱动着地球尺度的生物地球化学循环，然而，现有的科学研究中，对深海微生物群落的功能探索远远落后于其他环境。

实验的重点是在4000米的深度采集的样品，每个站点分析了两个不同大小的组分，分别代表FL (0.2 ~ 0.8 μm)和PA (0.8 ~ 20 μm)原核群落。

虽然这两个群落包括原核生物，但PA组合还包括微生物微真核生物及其推定的共生体，FL组合包括一些病毒。

笔者通过本实验分析了来自热带和亚热带深海的58个宏基因组，建立了马拉斯皮纳基因数据库。

实验发现，在自由生活的微生物群落中，氨和CO氧化途径丰富，在附着颗粒中，异化的硝酸盐还原为铵和H(2)氧化途径，而Calvin Benson-Bassham循环是两种粒径组分中最普遍的无机碳固定途径。

这些结果扩大了我们对地球上最大的水生生态系统的功能微生物结构和代谢能力的理解。

一、深海异养微生物无机碳及有机碳来源推测与实验设想

大多数海洋生物与地球的主要能源——阳光隔绝，除了生活在永久的黑暗中，深海生物还必须应对和适应这个生态系统的高压和低温。

这个迷人的栖息地代表了地球上最大的生物群落之一，主要由细菌和古细菌占据，在地球尺度上的生物地球化学循环中起着关键作用。

深海中的微生物代谢被认为主要是异养的，依赖于从阳光照射层通过下沉颗粒(浮游动物粪便颗粒、浮游植物聚集体和其他类型)输出的有机物。

在暗海洋中测量到的高呼吸活动很少与光层中产生的有机碳供应速率相一致，这意味着可能存在其他碳来源，我们推测，潜在的非下沉POC和本地微生物化能自养生物的原位生产。

化学岩石自养被认为是支持深海高呼吸活动的可能途径。

实验速率测量和大量生物地球化学估计与单细胞基因组学的发现一致，即普遍存在的细菌谱系具有无机碳固定的潜力，这表明化能岩石自养可能是深海代谢的重要贡献因素，并且可能在全球海洋碳循环中发挥比以前认为的更大的作用。

虽然无机碳固定的能量消耗较高，但进行化学岩石自养无机碳固定和异养，可能是微生物在暗海洋中生存的一种成本效益高的策略，目前其在全球深海中的普及程度尚未得到确切验证。

尽管来自化化岩石自养的有机碳具有潜在的重要性，但颗粒可能代表了深海还原性碳的主要来源，并构成了微生物活动的重要热点，为暗海食物网提供燃料。

它们可以是快速下沉的颗粒，在几周内穿过水柱，也可以是浮力或缓慢下沉的有机颗粒，它们在一年的时间尺度上悬浮在深海中。

向深海输送快速下沉的微粒取决于表层海洋的营养和功能结构，这种通量是间歇性并且在空间尺度上分布存在差异，这可能导致全球海洋中深海微生物代谢能力的分布不均。

深海原核生物群落的多样性和生物地理学最近在全球范围内进行了描述，表明自由生活(FL)和颗粒附着(PA)微生物群落在分类组成上存在很大差异，并且似乎是由不同的生态驱动因素构成的。

FL和PA原核生物之间的生活方式二分法被证明是深海微生物的一种系统发育保守特征，然而，这两组微生物在功能能力上的差异在很大程度上仍未被探索。

尽管在局部/区域尺度上进行了一些研究，但对深海细菌和古细菌微生物的生态学和代谢过程仍然缺乏类似于对上层光海洋的了解。

2010年马拉斯皮纳环球探险旨在通过调查热带和亚热带海洋的深海微生物来解决这些知识空白，基于此，我们分析了来自该探险队的58个深海微生物宏基因组，并发布了Malaspina基因数据库(M-GeneDB)。

本实验还构建了Malaspina深海宏基因组组装基因组(MDeep-MAGs)目录，以探索深海微生物组的代谢潜力。

二、样本收集和DNA提取

对于每个样品，120 l海水依次通过200 μm和20 μm滤网过滤，以去除大型浮游生物。

通过蠕动泵将水连续泵入孔径为0.8 μm和0.2 μm的142毫米聚碳酸酯膜过滤器中进行进一步过滤。

将过滤液快速冷冻在N(2)液中，保存在- 80°C，直到提取整个群落的高通量离散测序。

宏基因组测序的过滤器用无菌刀片切成小片，每个过滤器的一半用于DNA提取，使用稍加修改的标准苯酚-氯仿方案进行提取。

实验所用的Malaspina深海微生物宏基因组从DOE的JGI集成微生物基因组和微生物组(IMG/MER)中获得了原始和干净的序列，并分析了一些数据。

实验观测期间还收集了额外的元数据，包括环境变量(盐度、位势温度和氧浓度)、采样站坐标(纬度、经度和深度)以及每个样本的辅助数据(过滤器尺寸、海洋盆地和水团;补充数据1)。

对每个组装的宏基因组中大于100 bp的所有3,872,410个预测编码序列进行汇总，并对较小序列进行95%序列相似性和90%序列重叠的聚类，获得1,115,269个非冗余基因簇(从现在起简称为基因)。

这些基因簇与UniRef100从NCBI的分类数据库中获得UniRef100最佳匹配的最小共同祖先分类分配。

每个样本的估计基因拷贝数除以总拷贝数，以获得相对丰度，并对不同采样深度进行校正。

核胞质大DNA病毒(NCLDV)标记基因，包括主要的衣壳蛋白和DNA聚合酶，在58份Malaspina深层宏基因组学样本中使用NCVOG和PSI-BLAS进行检测。

对于病毒噬菌体序列的检测，则首先使用BLAST对三种病毒噬菌体(Sputnik、Mavirus、OLV)的蛋白质组序列进行宏基因组筛选。

紧接着对UniRef100(98)进行宏基因组命中搜索，结果表明，365条宏基因组肽段与噬菌体序列的吻合度最高，其中50条序列与侵染自助食堂的Mavirus噬菌体同源序列的同源性>95%。

实验中，我们利用标记基因terL(末端酶大亚基)评价了深海微生物宏基因组中细菌和古细菌病毒的多样性。

在58个宏基因组预测的蛋白中鉴定出terL基因，短于100 bp的基因被丢弃，得到485个terL基因的数据集。

通过选择氮、硫、甲烷、氢和碳固定代谢途径的特定酶，研究了在深海主要生物地球化学循环中起关键作用的代谢。

在可能的情况下，将标记酶分配到图谱中的特定模块，标记酶的校正丰度估计是通过EC功能丰度表(无亚采样)的读取数除以原核生物单拷贝基因recA的读取数得到的。

我们建立了83个ko表，代表了与深海不同代谢途径相关的主要关键标记基因，其中，Malaspina Deep-Sea Gene Collection共发现49个ko。

为了建立马拉斯皮纳深层宏基因组组装基因组目录(MDeep-MAGs)，将马拉斯皮纳探险的所有58个宏基因组汇集并共同组装。

在CheckM中估计了MAG的完整性和单拷贝基因冗余(污染)，并使用完整性大于50%且污染低于10%的每个MAG在原核生命树中的位置来绘制描绘它们之间系统发育关系的树。

我们对所有619个箱子都进行了注释，包括基因预测、tRNA、rRNA和CRISPR检测。

共从固定碳、甲烷、氮、氢和硫代谢中选择了83个标记基因，并沿低品质(LQ)箱、中品质(MQ)箱和高品质(HQ)箱中探测到了它们的存在。

在mdeepmag中进一步探索了25个mag池，突出了趋化石自养，混合养和非蓝藻重氮营养体(NCDs)的潜力。

三、Malaspina基因数据库(M-GeneDB)的分类组成

58个微生物宏基因组取样于北纬35°至南纬40°之间，来自南北太平洋和大西洋、印度洋和南澳大利亚湾的32个站点(St)，平均水深为3731米。

每个站点分析了两种不同大小的浮游生物组分，分别代表FL(0.2-0.8µm)和PA(0.8-20µm)微生物群落，后者还包括深海微生物真核生物。

总共产生195个Gb (6.49 × 10对)的数据，平均每个样本3.36 Gb。

从58个组装的深海生物宏基因组中预测的基因数量为403万个(M)，首先以95%的序列一致性对核苷酸序列进行聚类，以消除冗余，产生1.12 M个非冗余唯一序列簇(以下简称基因)。

M-GeneDB的新颖性体现在总共647,817个马拉斯皮纳特有基因中，占Tara Oceans全球调查中缺失基因总数的58%，代表了与Tara Oceans报告的上远洋和中远洋基因互补的独特基因库。

M-GeneDB的63%“未知”基因没有功能注释，余37%的基因与转运蛋白相关，包括双组分系统和ABC转运蛋白(>9.7%)，其次是DNA修复和重组蛋白(2.6%)和肽酶(1.8%)。

其他大于1%的基因是分泌系统、氨基酸相关酶或群体感应基因，这些结果与之前关于这些基因在深海中普遍存在的发现一致。

这个数字反映了光和无光微生物组之间的垂直功能分层和二分法，以及中深海和深海微生物组之间的差异。

尽管下沉颗粒在将上层海洋微生物运送到深海中发挥了作用，但在几个Malaspina采样站中已经描述了特有的深海微生物的存在。

每个样本中平均发现有61个(±14% SD)的预测基因在本数据集中，这突出了深海微生物组的独特基因含量。

样本特异性基因的比例最高，占总数的43%，在分类群落组成方面也存在很大差异。

M-GeneDB中基因的分类关系表明，它们大多数属于细菌和古细菌结构域，在大小部分和真核生物中都有少量病毒代表，这些病毒主要存在于PA部分。

微生物分类利用从宏基因组中提取的不同标记基因，对深海样本中的原核生物、giruses病毒进行了评估。

所鉴定的多样性与先前基于来自同一样品的18S(42)和16S rRNA(26) PCR扩增的结果一致。

核胞质大DNA病毒(NCLDVs)的鉴定显示它们在大小分数和所有海洋盆地中都普遍存在。

大病毒科在深海中占主导地位(FL和PA分别占76%和63%)，这一结果与大病毒科在阳光充足的海洋中的较低比例(36%)形成鲜明对比。

虽然以前的研究也显示了FL和PA微生物群落的基因库的对比，但它们仅限于在光海洋，沿海生态系统或智利海岸的氧气最低带(OMZ)的局部尺度上的一些研究，并且尚未提出全球比较。

本次实验评估了不同海洋区域、盆地和生活方式(FL或PA)对确定深海原核生物功能结构的影响。

通过评估，我们基本确定了与PA和FL群落对应的两个主要功能群样本。

基于KEGG同源群(KOs)聚类，基于58个样本间功能组成相似性(Bray-Curtis距离)的微生物群落非度量多维标度(NMDS)。

深海的FL和PA原核微生物群落不仅代表了先前认识到的不同分类群，而且对应着具有一贯不同功能特征的生活方式。

为了探索FL和PA原核微生物群落之间潜在的代谢差异，我们在深海元基因组数据集中搜索了与深海中无机碳固定、氮、硫、甲烷和氢代谢相关的潜在相关途径相关的标记基因。

在这些关键标记基因中，M-GeneDB中存在49个KOs，四种不同无机CO2固定途径的关键基因。

Malaspina基因数据库中49个不同自养碳固定途径、氮、硫、甲烷和氢代谢的标记基因的标准化基因丰度。

通过氨和亚硝酸盐氧化进行的硝化作用被认为是暗海洋中固定碳的主要能量来源。

对于氨氧化，我们寻找标记基因甲烷/氨单加氧酶亚基对应的KEGG同源物K10944 (pmoA-amoA)和蛋白家族PF12942来鉴定古菌氨单加氧酶亚基a。

这两个标记在样品中的丰度呈正相关，它们存在于约36%的样品和6%的微生物细胞中，主要存在于FL微生物中。

对于亚硝酸盐氧化，在81%的样品和约4%的微生物细胞中发现了硝酸盐还原酶/亚硝酸盐氧化还原酶(K00370/K00371)，尽管该酶也可以参与其他代谢过程，如异化硝酸盐还原和反硝化。

为了验证它们，有必要在宏基因组箱中探索每条途径的其他关键基因的共现情况。

其他相关硝化基因，如羟胺脱氢酶(K10535: hao)或厌氧氨氧化剂的关键酶通常存在于中远洋海洋的最低氧区，但在我们的深海宏基因组数据集中却没有发现。

这一现象反映出缺氧中深海OMZ和缺氧深海海洋发生的不同生物地球化学过程，H2和CO氧化被认为是潜在的替代能源。

已经在热液喷口或地下微生物群落中发现了H2-氧化，我们也在24%的样品中发现了H2-氧化（主要是在PA微生物中）。

这些结果扩大了深海中微生物H2氧化剂的生态位，可能与提供缺氧微环境的颗粒有关，这种微环境有利于通过发酵产生H2。

CO的氧化由CO脱氢酶(CODH)催化，并与放线菌门、变形杆菌门以及拟杆菌门和绿藻门的成员有关。

cox基因氧化CO在87%的样品中均被检测到，并且具有高丰度，主要存在于FL原核生物中，这一观测现象表明CO氧化是深海异养生物重要的能量补充。

在含氧良好的水域中，这种代谢的普遍存在可能是由于有机聚集体或颗粒内部形成了微环境，在微环境中，强烈的呼吸可能导致局部O2耗竭。

这一发现支持了同化和异化硝酸盐还原途径在PA部分都富集的假说。

虽然大多数样品中存在DNRA的潜力，丰度高达潜在微生物细胞的34%，但反硝化作用的丰度较低。

在5-13%的细胞中，在大多数FL和PA微生物群落中发现了异化硫酸盐还原基因。

综合所有观测现象和数据后，我们发现CBB循环分布在这两个大小的组分中，而CO氧化或氨氧化在FL和H2氧化中富集，相反，在PA微生物群落中富集DNRA。

58个深海元基因组的共组装允许重建619个非冗余桶，平均基因组完整性为57.2%，总计1.4 Gbp。

其中317个箱子的基因组完整性值≥50%，污染<10%，符合质量标准(61个)，被认为是中等或高质量的宏基因组组装基因组(MAGs)。

这317个MAGs，平均基因组完整性为84.2%，总计936 Mbp（这个数据集在这里被称为Malaspina Deep MAGs目录）。

根据GTDB分类，共有298个细菌MAGs被分类到22门，19个古细菌MAGs被分类到4门。

细菌种类较多的是γ变形杆菌门(n = 82)和α变形杆菌门(n = 67)。

MDeep-MAGs在分类上具有显著的新颖性，在古细菌和细菌MAGs中分别有>68%和58%的新种。

在细菌中，MAG0213被分配到一个新的类，一个MAG可能代表一个新目，五个MAG可能代表不同的新家族，在古细菌的情况下，我们发现MAG0485可能代表纳米古细菌门中的一个新家族。

这些高于全球海洋Tara海洋数据集的光层报告，特别是地中海，其显示不同微生物大小部分的宏基因组读取的平均定位率为14%。

这种差异可能是由于测序深度的差异和研究之间共组装、过滤和映射的方法差异。

到目前为止，这个细菌家族中只有一个培养的成员与粘球菌相关的MDeep-MAGs的分类新颖性特别高，因此，我们可能在深海中发现了这些大基因组微生物的新生态位，其中一些已被证明可以产生抗菌、抗真菌和其他生物活性代谢物。

MDeep-MAGs目录代表了来自深海的最广泛的基因组数据集，用于研究深海微生物的分布和功能。

深海中非蓝藻重氮营养体(NCDs)的生态相关性尚不清楚，因为碳基质的可用性似乎不太可能支持N2固定所需的能量需求。

最近在全球海洋表面发现了与plantomycetota和Proteobacteria相关的新基因型，其中一些基因型甚至在中深海深处也被积极转录。

深海中非传染性疾病的多样性主要是通过检测nifH基因来了解，在Malaspina数据集中重建了3个NCD MAGs，其中包含nifH基因和nif操作子的其他结构基因。

nifKD基因其中2个是与Salipiger thiooxidans和Novosphingobium属相关的Alphaproteobacteria ，它们都具有几乎完整的基因组(>94%的完整性)。

PA组分中α变形杆菌重氮营养MAGs的存在与北太平洋副热带环流下沉中浮游颗粒中重氮营养细菌的发现非常吻合，然而，这三种mag的分布仅限于有限数量的样本。

MAG0509与Salipiger thiooxidans密切相关，Salipiger thiooxidans是一种从黑海分离出来的硫氧化性岩石异养细菌。

除了nifH和来自nif操纵子(nifK)的其他结构基因外，该MAG还具有RuBisCo的两个基因(形式I和IV)， CO氧化的cox基因和硫代硫酸盐氧化的soxY基因，指向潜在的化质自养重氮化。

这些结果可能反映了该分类群具有更高的代谢多样性，在深海中存在以前未被发现的化能石自养重氮营养体。

与Novosphingobium相关的其他alphaprobacia基因组也很有趣:尽管已知该属的成员代谢多样，通常与芳香化合物的生物降解有关，但它们通常是从受人类活动影响的地点分离出来的。

唯一已知的能够固定N2的物种是Novosphingobium nitrogen - ifigens，它是从纸浆和造纸废水生物反应器中分离出来的，具有积累聚羟基烷酸盐的能力。

γ变形杆菌NCD MAG与Ketobacter属有关，其中Ketobacter alkanivorans是唯一从受漏油事故影响的海水中分离出来的物种，并且具有降解烷烃的能力。

实验中我们观察到，在该基因组中还检测到烷烃羟化酶(alkB)和卤烷脱卤酶(dhaA)基因，因此它可能能够降解合成卤烷，其中一些用于制造尼龙长丝、纤维、塑料和其他顽固性化合物。

我们对NCDs MAGs中这三个nifH基因变异的系统发育分析证实了它们与Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria的关系。

从对比鲜明的海洋区域，如北大西洋中远洋和深海、地中海中部或北冰洋，收集的数据推断出深海中化学岩石自养的生态相关性。

深色海洋含氧水柱中的细菌和古细菌使用各种还原的无机化合物，如氢、硫代硫酸盐/硫化物和氨作为能量来源。

为了进一步明确哪些是涉及的关键微生物，以及它们在全球深海中的流行程度，我们研究了与深远洋相关的氨、硫和亚硝酸盐氧化相关的代谢以及其他较少探索的代谢。

在这个过程中，我们发现了2种氨氧化古菌(AOA)， 3种潜在的硫氧化细菌(SOB)， 1种氨氧化细菌(AOB)和1种亚硝酸盐氧化细菌(NOB)。

古菌AOA属于亚硝酸菌的不同种，仅在12%的样品的游离部分出现。

AOA MAGs中amoA基因的系统发育分析表明，它们与其他深海amoA序列密切相关。

在这两个AOA MAGs中，我们检测到古细菌3-羟丙酸- 4-羟丁酸自养二氧化碳同化途径的关键酶，与硫单胞菌属相关的两种细菌SOB在单个站点显示出有限的分布，并且在自由生活部分中富集。

我们发现总共有90个(28%)MDeep-MAGs含有coxL (K03520)基因，其中46%还含有CBB循环的RuBisCo基因，这些基因支持了它们自养的潜力。

一些将单细胞基因组学与荧光原位杂交和/或显微放射自显影相结合的研究已经报道了一些无机碳固定途径的相关性，例如与亚硝酸盐氧化细菌相关的CCB和rTCA循环。

不过在广泛的地理尺度和基因组水平上，远洋和深海中不同无机碳固定途径的普遍程度尚不明确。

虽然我们缺乏直接证据表明这些基因组确实可以进行无机碳固定，但实验结果揭示了它们潜在的遗传能力，并激发了未来的实验来表征深海中这些新型混合营养、化化岩石自养和重氮营养谱系的生态相关性。

这项研究为317个基因组在深海中的分布和生物地球化学潜力提供了证据，未来的研究将整合超转录组学、代谢组学和单细胞功能分析，例如使用NanoSIMS，将有助于连接基因组的存在和活性。

总结

我们的实验结果不仅突出了深海中主要潜在生物地球化学过程的分布，其中一些过程呈现斑块状分布，而且还将特定的代谢途径归因于深海FL或PA原核生物。

我们的NCDs MAGs包括以前未被发现的深海中化学岩石自养重氮营养体。这些固氮微生物表现出代谢多样性，并与多个生物地球化学循环耦合。

通过建立Malaspina基因数据库和Malaspina Deep MAGs目录，对深海微生物组进行全球宏基因组评估，揭示了潜在的深海微生物新目和新类别，并描述了热带和亚热带深海深海微生物组潜在的相关生物地球化学过程。

我们的研究结果表明，代谢分化反映在FL和PA原核组合之间的功能基因库的对比中，并且在海洋和盆地之间也存在一定程度的功能斑块。

我们的研究也为深海中不同的代谢策略提供了证据：深海中不同自养途径的广泛分布以及替代能源(如CO氧化、硫氧化和H(2)-氧化)的普遍存在，支持了多种自养过程在补贴由光层输出通量支持的异养代谢中的作用。

这些自养过程依赖于在上层海洋中光合作用减少的无机化合物，因此在严格意义上不构成初级生产。

在自养过程中，洋流将来自上层海洋的额外能量资源输送到深海微生物中，使得深海的呼吸需求超过了那些仅由光层的颗粒有机通量支持的呼吸需求。

参考文献

<1>贺惠，《海洋沉积物中微生物基因组DNA提取方法的比较研究》

<2>傅莲英，《海水养殖沉积环境微生物总DNA的提取方法研究》

<3>冯玮，《宏基因组技术及其在海洋微生物研究中的应用》

<4>张燕娇，《深海和极地细菌的多相分类学研究及深海细菌Rheinheimera nanhaiensis E407-8的基因组学分析》

<5>金光，《海洋新菌的分类与鉴定方法》

<6>储新民，《南海海洋微生物宏基因组文库中酯酶基因的筛选与鉴定》