我国经济水平的不断提高，餐饮业逐步扩大，排放的废水也随之增多
随着我国经济水平的不断提高，餐饮业逐步扩大，从而排放的餐饮废水也随之增多。
餐饮废水是一种量大而面广的污染源，若不经处理直接排放到环境中会污染水体，管道输送期间易造成堵塞。
目前用于含油废水处理的方法有物理法、化学法和生物法，其中包括膜过滤、树脂吸附、过氧化氢氧化、溶剂萃取等物理、化学法，但存在设备需求大、成本高、毒性较大、处理效果差等缺点，而生物法处理含油废水具有操作简便、成本低和不产生二次污染等优点。
脂肪酶是一种特殊的甘油三酯水解酶，使甘油三酯水解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸，并且能催化水解，酯化和醇解反应。
脂肪酶主要来源于动物、植物和微生物等。
其中，微生物来源的脂肪酶具有如下特点：能催化更多反应，产量高、遗传操作简便，更稳定、安全、方便，且微生物的生长效率非常高，可不受季节影响、可全年供应。
因此，分离筛选出高脂肪酶活性且性能稳定的微生物对环境和食品工业等领域有重要应用意义。
脂肪酶产生菌包括细菌、酵母菌和霉菌，其中可产生脂肪酶降解油脂的细菌有不动杆菌、假单胞菌属、微杆菌属等，酵母菌有解脂耶氏酵母、皱褶假丝酵母、毕赤酵母、红酵母等，霉菌包括根霉属、曲霉属、青霉菌属等。
朱超等从废水处理厂污泥池中分离筛选得到一株芽孢杆菌，在初始油脂质量浓度为2g/L下油脂降解率为75.53%；PHAM等人利用吐温-80平板筛选出了2株赖氨酸芽孢杆菌，产脂肪酶活力最高可达480U/mL。
秦昊等从富含油脂的土壤中分离出一株荧光假单胞菌，在最适条件下该菌株产脂肪酶活力可达79.87U/mL。
然而，微生物天然菌株往往降解油脂和产酶能力不强，因此仍需通过进一步的手段对产脂肪酶菌株酶活进行优化，景智波等采用响应面法优化乳酸菌产脂肪酶活性，在最佳发酵条件下乳酸菌TR1-1-3酶活性为10.92U/mL，较优化前有所提高。
王艳霞等采用单因素结合正交实验优化卷枝毛霉产脂肪酶发酵条件，在60℃以下保温100h酶活仍能保持80%以上。
AMIN等利用响应面法提高青霉产脂肪酶活力，在优化后的工艺条件下菌株产脂肪酶活力可达1038.86U/g，较优化前提高了2.05倍；ABU等人采用Plackett-Burman和Box-Behnken优化毕赤酵母脂肪酶的发酵参数，优化后菌株产脂肪酶酶活为2.0U/mL，提高了3倍。
可见，在传统优化方法下脂肪酶酶活仍然有较大的提高，这些优化工艺是脂肪酶实现商业化的重要手段，还需不断深入研究并总结。
虽然之前的研究中获得了产酶能力高的菌株，且有微生物实现了工业化生产，然而，之前的这些研究主要都是以低油废水为底物，分离筛选到的油脂降解菌也主要是针对低油废水发挥效果，针对高油废水的高效降解菌种类较少，适用性较差，应用受限，有待进一步挖掘。
另外，脂肪酶高产菌在实际环境中常常会因为适应性差、分散不足或存在抑制剂等情况导致其效果大大减弱。
因此，本研究将从自然环境中分离筛选脂肪酶高产菌，综合考虑菌株的油脂降解率和脂肪酶活力，以期开发出能有效降解高浓度油脂的产脂肪酶菌株，为高油废水的微生物降解提供潜力菌株。
从贵州大学周边餐馆厨房污水排放沟多个位置进行取样，将取到的污水和污泥进行混合制样。
牛肉膏、琼脂粉、酵母浸出粉，北京索莱宝科技有限公司；蛋白胨、氯化钠、无水乙醇，成都科龙化工试剂厂；对硝基苯酚、棕榈酸对硝基苯酯，上海易恩化学技术有限公司。
改良R2A-SE培养基（g/L）：氯化铵0.8g、硝酸钾0.505g、酪蛋白水解物0.5g、葡萄糖0.5g、蛋白胨0.5g、丙酮酸钠0.5g、可溶性蛋白质0.5g、酵母浸出粉0.5g、K2HPO4 0.4g、KH2PO4 0.25g、MgCl2·6H2O20.0mg、CaCl2·2H2O15.0mg、FeSO4 ·7H2O7.0mg、MnCl2·4H2O5.0mg、Na2SO4 5.0mg、CoCl2 ·6H2O0.5mg、H3BO3 0.5mg、NiSO4·6H2O0.5mg、ZnCl2 0.5mg、CuCl2·2H2O0.3mg、Na2MoO4·2H2O10.0µg、琼脂15~20g，蒸馏水1.0L，121℃高压灭菌15min，pH7.0±0.2；SE:土壤浸出液，称取1g样品于100mL带有玻璃珠的无菌水中，摇床震荡4~5h后用0.2μm膜过滤除菌。
SE以10%的添加量加到已灭菌熔融的R2A培养基中混匀即可。
NA培养基（g/L）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15~20g、蒸馏水1.0L，pH7.0±0.2。
YPD培养基（g/L）：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母浸粉5g、琼脂14g，蒸馏水1.0L，pH6.0—6.6。
中性红培养基：于NA/YPD培养基中加入1.6%中性红水溶液1mL、油脂10mL。
三丁酸甘油酯培养基：于NA/YPD培养基中加入40mL三丁酸甘油酯乳化液，14g琼脂，121℃灭菌20min。
细菌产酶培养基（g/L）：蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠5g、菜油乳化液40mL，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
真菌产酶培养基（g/L）：蛋白胨10g、酵母浸粉5g、葡萄糖5g、菜油乳化液40mL，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
降解培养基（g/L）：(NH4)2SO4 2.0g、K2HPO4 2.0g、NAH2PO4 2.0g、NaCl5.0g、油20g，pH自然。
无菌条件下称取1g样品于9mL无菌水试管中，制成1:100的稀释液，并稀释至10-5、10-6、10-7梯度。
选择10-5、10-6、10-7梯度菌液为涂布样品，分别吸取100μL菌液至加入了中性红、菜油的R2A-SE、NA、YPD培养基平板中进行涂布，将涂布后的平板分别于37℃、30℃恒温培养箱中培养12h、48h。
观察菌落周围是否变红，挑取不同形态的变红菌株于对应平板划线纯化2~3次。
将纯化后的菌株接种于产酶基础培养基中，30℃、180r/min振荡培养72h获取上清液，用打孔器在初筛培养基平板打三个大小均匀的孔，注入50μL上清液，于恒温培养箱中培养72h，观察并用游标卡尺测量透明圈大小，以此初步判断酶活大小，取透明圈较大的菌株进行油脂降解率和酶活力测定。
采用紫外分光光度计法，以稻米油为溶质、石油醚为溶剂，制成0.2、0.6、1、1.4、1.6mg/mL浓度标准溶液，找到最大吸收波长，在最大吸收波长下测定不同稻米油油浓度的吸光度值，绘制标准曲线。
将复筛后的菌株经培养得到种子液，以体积比的10%的量接入降解培养基，在30℃、180r/min条件下摇床培养24h、48h、72h后测定其降解率：使用石油醚对上清液进行两次萃取，然后用石油醚定容至25mL，在最大吸收波长下测定样品吸光值，判断其降解率大小及变化趋势P，油脂降解率，%；C，初始油脂浓度，mg/mL；Ctest，剩余油脂浓度，mg/mL。
粗酶液的制备：将复筛后的菌株活化后，按体积比的10%接入产酶培养基中，30℃、180r/min振荡培养48h，在离心力为3330×g下离心5min，获得的发酵上清液即为粗酶液。
酶活力测定：采用对硝基苯酚法进行酶活力的测定，先绘制对硝基苯酚标准曲线：配制0、5、10、15、20、30、40、60、80、100μmol/L系列浓度标准溶液，在410nm下测定光吸收值。
取2根试管，分别为对照管和样品管，在两试管中加入20μLp-NPP底物溶液、780μLTris-HCl缓冲液，于37℃水浴锅中预热5min，然后在对照管中加入200μL已灭活酶液，样品管中加入酶液200μL，准确反应10min，立即加入1mL三氯乙酸终止反应，5min后加入3mLNaOH调pH，于410nm处测定吸光度。
脂肪酶活力定义：在一定条件下，将每分钟产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活力单位（U）。
初步鉴定：对筛选的高效菌株进行形态学观察和革兰氏染色，进行初步鉴定；
分子生物学鉴定：采用冻融法提取目的菌株的基因组，以总DNA为模板，以细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)为引物进行PCR扩增，PCR扩增反应体系：基因组DNA2μL，2×TaqPCRMasterMix II 25μL，上游引物27F1μL，下游引物1492R1μL，ddH2O21μL；反应参数：94℃预变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，33个循环；72℃终延伸10min，4℃维持。
对于真菌，以通用引物ITS-1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’）为引物，进行ITS片段扩增，PCR扩增反应体系：基因组DNA5μL，2×TaqPCRMasterMix II 25μL，上游引物ITS-15μL，下游引物ITS-45μL，ddH2O10μL；反应参数：95℃预变性5min；95℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min，4℃维持。
用1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳验证目的片段。
后送样测序，所得序列BLAST比对进行同源性分析。