基于有磷的根际细菌群落，对碱性磷酸酶ALP活性在黄酸性土的作用
«——【 ·前言· 】——»
含有phoD的细菌编码碱性磷酸酶，这是一种分泌酶，可将有机磷水解为土壤中的可用形式。
通过实验得知耕作方式和作物类型对热带农业生态系统中phoD细菌丰度和多样性的影响在很大程度上是未知的。
我们在这项研究中，目的是研究农业实践（有机与传统）和作物类型对携带phoD的细菌群落的影响。
«——【 ·土壤变量和作物生物量· 】——»
经过有机农业处理的土壤pH值显著高于传统，在传统农业中，矿物质氮含量最高与有机处理相比，传统农业中速效磷显著增加，作物对速效磷的影响也显著。
微生物生物量P在有机农业中表现出显著较高的价值，作物对微生物生物量P的影响也显著，有机耕作实践中根和芽生物量最高，作物和农业实践对根和芽生物量的影响也显著。
«——【 ·ALP和 phoD 基因丰度· 】——»
两种农田植被作物根际土壤中土壤ALP活性和phoD基因拷贝数的变化如下：ALP 活性范围为 2.45–3.59 μmol g−1土壤 h−1有机至 1.46–2.96 μmol g−1土壤 h−1在传统的耕作土壤中。
在作物中，玉米表现出最高的ALP活性，大豆表现出最少，多元方差分析显示耕作方式和作物对ALP酶活性有显著影响，Tukey的HSD测试表明，在同一农业实践中，不同作物之间的ALP活性存在显著差异。
qPCR分析表明，与传统农业（4.5×106–1.1 × 107副本 g−1dws），有机农业的phoD种群要高得多，范围从6×106至 1.3 × 107副本 g−1DW玉米作物土壤样品中phoD基因拷贝丰度最高，其次是鹰嘴豆、芥菜和大豆土壤。
多元方差分析结果显示，耕作方式和作物类型对phoD基因拷贝丰度有显著影响，Tukey的HSD测试表明，不同作物之间的phoD丰度存在显着差异。
«——【 ·细菌群落与土壤参数· 】——»
phoD 扩增子 674 × 076 对末端测序共生成了 2，300 个原始读段，每个样本平均有 84，260 个读段，严格的低质量过滤导致总共有254，895个高质量读数用于下游分析。
为了比较不同样品中携带phoD基因的细菌群落，进行了序列/读取的稀疏性，以获得由相同数量的序列分配的OTU。
我们将最小文库大小的序列稀有到每个样本的2629个读数，phoD OTU 的范围在 346 到 672 之间，每个样本的平均 OTU 为 ~457 个。
在经过有机农业处理的土壤中观察到的phoD基因细菌的OTU组成大于传统土壤，据报道，有机农业玉米作物土壤中的OTU最高，其次是鹰嘴豆、芥末和大豆种植的土壤。
«——【 ·phoD细菌群落· 】——»
所有的phoD读数都隶属于变形杆菌门和放线菌门，变形杆菌是优势门，占所有序列的65.24–94.57%。
这些OTU被分为八个细菌目，包括根瘤菌属，链霉菌属，假单胞菌属，红杆菌属，杜鹃螺旋体，伯克霍尔德菌属，假无心菌和微单孢子菌，根瘤菌在所有样品中占优势，占37.28–78.27%。
含磷D的细菌顺序因耕作方式和作物而异，但未观察到特定趋势，共鉴定出29属，其中优势属为缓根瘤菌属（4.41-42.73%）、根瘤菌属（1.04-49.65%）、链霉菌属（3.29-37.08%）、中根瘤菌属（3.36-29.12%）、中华 根瘤菌属（2.28-23.55%）、假单胞菌属（0.15-15.62%）和斯克曼氏菌属（3.75-15.43%）。
在鹰嘴豆种植下的有机农业实践中，缓根瘤菌的相对丰度最为突出，此外，假单胞菌在有机处理中也表现出较高的相对丰度，而链霉菌在传统耕作土壤的大豆种植中富集。
«——【 ·土壤取样和土壤理化分析· 】——»
在作物生长周期的开花中期随机收集来自（有机和常规）农田的一式三份（0-15 cm）根际土壤样品，在塑料袋中轻轻敲击每种试验作物的根部后，收集粘附在根际区的土壤。
将土壤样品（一式三份）混合并均质化并筛分（2毫米目数）以去除植物碎屑。
均质化的土壤样品分为两部分：一部分储存在-20°C，用于下游分析含有phoD的细菌群落和qPCR实验，另一部分储存（在4°C）用于分析ALP活性和土壤性质。
连续两年（2017–2019年）测定土壤样品的土壤理化性质、碱性磷酸酶活性和phoD基因丰度，并将数据合并为两年的平均数据，仅对第二年土壤样品进行phoD多样性分析。
按照标准协议分析土壤的所有基本物理和化学性质，根据Allen等人分析总P。
为了测量土壤速效P，遵循Olsen等人的方法，微生物生物量磷按照Brookes等人的标准方案进行测量，作物生物量根据Neha等人进行测量。
«——【 ·ALP活性测定· 】——»
使用对硝基苯酚磷酸酯（p-NPP）作为底物，测定ALP活性，通过取根际土壤（1 g）和1 mL改良通用缓冲液（pH 11），p-NPP并在37°C下孵育1小时进行分析。
1小时后，混合0.5M NaOH以终止反应，过滤反应混合物，并通过分光光度法（在420nm处）测量对硝基苯酚，该活性被记录为μmol的p-NP g−1土壤 h−1。
«——【 ·土壤 DNA 提取· 】——»
采用FastDNA离心试剂盒从0.5 g冻土中提取总基因组土壤DNA，NanoDrop 2000分光光度计用于测量DNA浓度和质量。
通过qPCR，使用ALPS F-730和ALPS R-1101引物扩增提取的DNA为phoD。
PCR 反应混合物 （20 μL） 含有 10 μL 的 PowerUp，SYBR Green 预混液、每种引物浓度 （0 μM）、DNA 模板 （5 μL） 和水（无核酸酶）各 10.2 μL，最终体积为 20 μL。
phoD基因扩增的PCR条件如下：3°C下94分钟（初始变性），40°C下94次循环1分钟（变性），61°C下45秒（退火），72°C最终延伸45秒，测试数据的PCR扩增效率为114.5%，R2= 0.963。
«——【 ·phoD 基因扩增子· 】——»
Illumina Miseq 300 bp配对末端测序平台用于评估含phoD基因的细菌群体，使用ALPS-F730和ALPS-R1101引物在根际土壤DNA中扩增靶基因。
索引配对端文库是通过将Illumina Nextera XT兼容适配器添加到正向和反向引物序列中制备的。
反应混合物包括模板DNA，KAPA Hifi HotStart Ready Mix和修饰引物ALPS-F730和ALPS-R1101，PCR条件设置为初始变性（在94°C下3分钟），然后变性（在30°C下94个循环，1分钟），退火（61°C，45秒），延伸（72°C，30秒）和末端延伸（72°C7分钟）。
将扩增子净化并使用Qubit DNA高灵敏度的定量测定进行定量文库。
在 D7500 DNA 试剂盒和安捷伦生物分析仪的帮助下证实了文库的数量。
Illumina MiSeq 2×300 bp平台用于根据制造商的方案进行测序，生成的原始靶向phoD基因扩增子序列已存入NCBI序列读取档案（SRA）数据库，入库号为PRJNA797670。
«——【 ·序列分析· 】——»
根据对序列进行分析，并对phoD基因进行了轻微修改，FastQC用于概述原始正向（R1）和反向（R2）读数，以进行基本质量控制。
使用Trimmomatic V0.35对原始序列进行高质量过滤和修剪，标准包括（i）接头序列去除和（ii）消除不明确的读段（具有未定义核苷酸“N”>5%）和低质量序列的读段。
配对读取的质量传递（正向和反向）连接由PEAR（配对端reAd合并）执行，其余的单个读取被丢弃。
过滤掉质量得分为< 30、序列大小小于250 bp和超过380 bp序列的连接读段，以获得高质量序列（HQS）。
适当的管道微生物生态学定量洞察（QIIME）版本1.9.0用于分析高质量读数，以进行细菌多样性估计。
最初，使用默认设置的HMMER模型，根据funGene数据库对有关phoD序列的质量通过的读取进行筛选，这使我们能够仅获得phoD基因特异性扩增子读数，并过滤不需要的读取，例如16S rRNA污染和嵌合读取。
使用pick_otus.py脚本以75%的相似度聚类对phoD基因特征序列进行操作分类单元（OTU）测定，在丢弃具有<2629个读取计数的OTU后，将OTU稀薄到最小的库大小（1个读取），以找出分类多样性α指数，例如观察到的OTU，Good的覆盖率，Chao10，Simpson，Shannon。
读取的分类分类是使用Kaiju宏基因组分类器获得的，k-mer设置为31，集成到MGX软件中。
«——【 ·统计分析· 】——»
为了研究耕作方式和作物对土壤理化和微生物特性的影响，采用Tukey事后检验（p < 0.05）进行了多元方差分析，采用皮尔逊相关检验研究多样性指数与土壤参数的关系。
采用典型相关分析（CCA）评估耕作方式和作物的效果，利用PAST v 3.20探索土壤变量与携带phoD基因的细菌群落之间的相关性。
«——【 ·结论· 】——»
耕作方式和作物类型改变了含磷D细菌群落的组成，本研究表明，碱性磷酸酶活性、phoD丰度和OTUs丰富度随着有机农业实践的增加而增加。
根瘤菌在目一级表现出优势，检测到缓根瘤菌、恩西弗菌、链霉菌和假单胞菌为优势成员。
本研究将使人们更好地了解碱性磷酸酶的重要性及其在磷矿化中的作用，以改善磷管理策略，以维持农业的可持续发展。
未来需要研究不同种植制度下不同类型和数量的肥料对磷群落对刺激农业土壤磷有效性的影响。