浅析楚科奇海底沉积物的海洋细菌的多样性
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引言
楚科奇海在北极海域中的特殊之处在于其高纬度位置，这在全年大部分时间都有冰覆盖以及低平均年水温中得到了体现。即使在夏季，10-12米深的水层温度也几乎保持在零值附近。楚科奇海底是平坦的，大陆架的平均深度为50-60米，浅滩的深度为20-30米。
嗜食杆菌门家族Flavobacteriaceae是细菌门中的一个主要群体，已被报道为广泛分布于海洋环境中的微生物。Flavobacteriaceae家族包含大量的物种和属，但基于16S rRNA基因序列的一些属之间的系统发育关系直到最近才得到完全解决。基于嗜食杆菌门1000种模式菌株的整个基因组测序分析表明，Flavobacteriaceae家族是非单系的应进行划分。
提出了一个新的家族Weeksellaceae，其中包括Algoriella、Apibacter、Bergeyella、Chishuiella、Chryseobacterium、Cloacibacterium、Cruoricaptor、Elizabethkingia、Empedobacter、Moheibacter、Ornithobacterium、Riemerella、Wautersiella和Weeksella等属，作为一个独立于Flavobacteriaceae家族的类型属，形成了一个单独的支系。
材料和方法
菌株KMM 9713和KMM 9724T分离自楚科奇海深层底部沉积物，采样深度为29米，采用R/V Academician Oparin在2016年9月的远洋考察期间进行分离，具体步骤如前所述。这些新的细菌在28°C的海洋琼脂培养基或海洋肉汤培养基中进行革兰氏染色、氧化酶、过氧化氢酶反应和运动性的好氧培养，然后在MB 2216中加入20%的甘油冷冻保存在-70°C。
进行革兰氏染色、氧化酶、过氧化氢酶反应和运动性的测定。在MA 2216上生长并在碳包覆的200目铜网上用1%磷钨酸进行负染，然后通过电子透射显微镜Libra 120 FE检查细胞的形态。淀粉、酪蛋白、明胶、Tween 80、DNA、L-酪氨酸、壳聚糖的水解，以及在不同盐度NaCl）、温度和pH值下的生长使用人工海水进行，如之前描述的。
生化测试使用API 20E、API 20NE、API ID32 GN和API ZYM测试套装进行，除了培养物是悬浮在ASW中。菌株KMM 9713和KMM 9724T以及类型菌株Empedobacter tilapiae KCTC 62904T在30°C下在MA 2216上生长。
使用Silica gel 60 F254进行极性脂质的二维薄层色谱，第一方向使用氯仿-甲醇-水，第二方向使用氯仿-甲醇-醋酸-水，并喷洒特定试剂。脂肪酸甲酯按照微生物鉴定系统的程序制备。使用带有Supecowax-10和SPB-5涂层的毛细管柱进行FAMEs分析，分别进行等效链长值和样品保留时间与标准保留时间的比较。使用GC-MS Shimadzu QP2020分析FAMEs。
使用液体柱层析法在硅胶上分离链醌酮。将氯仿中的脂质提取物应用于柱上，带有链醌酮的中性脂质部分用三倍柱体积的氯仿洗脱。
使用GC-MS进行分析，SH-Rtx-5ms柱，温度从200°C到240°C，然后从240°C到325°C，保持在325°C 30分钟。进样口温度为300°C，质谱仪扫描范围为50-1000 m/z。采用Fautz和Reichenbach的方法调查了弯曲鲜红色素的存在。
实验方法概述
使用商业基因组DNA提取试剂盒从菌株KMM 9713和KMM 9724T中提取基因组DNA，按照制造商的说明进行操作。根据先前的方法进行PCR扩增和测序。将菌株KMM 9713和KMM 9724T的16S rRNA基因序列与最近亲缘菌株的序列进行比对，使用BLAST和EzBioCloud服务进行比较。
采用分子进化遗传学分析软件进行模型测试和系统发育分析。采用邻接连接法和最大似然法构建系统发育树，根据Kimura双参数模型计算距离。通过1000次重复的bootstrap分析估计系统发育树的稳健性。
使用High Pure PCR模板制备试剂盒从菌株KMM 9713和KMM 9724T中获得基因组DNA。使用DNA凝胶电泳和Qubit 4.0荧光计测量基因组DNA的数量和质量。使用Nextera DNA Flex套件制备DNA测序文库，然后在Illumina MiSeq平台上进行带对端的测序。
使用Trimmomatic版本0.39对读数进行修剪，使用FastQC版本0.11.8进行质量评估。使用SPAdes版本3.15.3 组装的contig用QUAST版本5.0.2计算基因组测量值。根据基因组学特定的工作流程使用CheckM版本1.1.3 估计基因组完整性和污染。
使用NCBI原核生物基因组注释管道和Rapid Annotation using Subsystem Technology对草案基因组进行注释。使用在线服务器ANI/AAI-Matrix和TYGS平台分别进行菌株KMM 9713和KMM 9724T及其最近邻居的平均核苷酸同源性、平均氨基酸同源性和数字DNA-DNA杂交值的比较。
使用基于一组400个保守的细菌蛋白质序列的PhyloPhlAn软件版本3.0.1执行系统基因组分析。通过OrthoVenn2进行全基因组分析的正交聚类和基因组之间的成对比较。使用antiSMASH服务器版本6.1.1进行次生代谢产物生物合成基因簇的注释。
使用Galaxy服务器版本2.0+galaxy2上的MacSyFinder程序进行菌株基因组中细菌蛋白质分泌系统和相关附属物的注释。使用网站Pfam 35.0识别出第IX型分泌系统的保守C-末端结构域。
使用dbCAN2元服务器版本10进行碳水化合物活性酶的识别，使用默认设置。服务器内集成的三种算法中的两种的预测足以用于CAZy家族分配。使用dbCAN3元服务器对基因组进行注释，相应的输出文件在S1文件中呈现。
使用eggNOG-mapper v2服务器对菌株KMM 9713和KMM 9724T的独特基因进行功能注释。根据RStudio版本2022.02.0+443和R版本4.1.3，使用pheatmap版本1.0.12软件包进行CAZymes的相对丰度和独特基因根据COG分类的分布进行热图可视化。
菌株KMM 9724T和KMM 9713的16S rRNA基因序列和基因组序列已在GenBank/EMBL/DDBJ下存档，存取编号为OP604014和LC379507，以及JANAIE010000000.1和JANCMU010000000.1。菌株KMM 9724T已经存放在韩国农业文化收藏中心，编号为KACC 22806T。
基因组特征和比较分析
菌株KMM 9724T和KMM 9713的整个基因组序列是通过Illumina MiSeq平台测定的。根据CheckM评估，两个基因组的完整度高达99.01%，没有污染。从基因组中提取的16S rRNA序列与PCR扩增得到的序列完全相同。
草案基因组被de novo组装成108个和47个contigs，N50值分别为440,336 bp和448,720 bp，L50值分别为3和2。基因组大小分别估计为2.62 Mbp和2.67 Mbp，覆盖率分别为180倍和140倍。基因组序列符合细菌分类的最低标准。基因组序列总共包含2,366和2,348个基因，37和38个tRNA，以及3个rRNA基因。
根据RAST注释，KMM 9724T型菌株的基因组显示有220个功能子系统，其中约49%的已注释基因分配给三个子系统：“蛋白质代谢”、“氨基酸及其衍生物”和“辅因子、维生素、假体群、色素”。蛋白质降解的蛋白酶中预测了氨基肽酶、金属羧肽酶、二肽酶、丝氨酸内切蛋白酶、ω蛋白酶和ATP依赖蛋白酶。
根据注释，菌株具有抗生素和金属抗性基因，以及生物素生物合成基因。antiSMASH分析显示，基因组编码了一个用于萜类生物合成的次生代谢物簇。另一个KMM 9713菌株的基因组在功能子系统的基因分布上与稍有差异。
基因组中细菌蛋白质分泌系统的注释是使用MacSyFinder程序进行的。KMM 9724T和KMM 9713菌株都具有用于第IX型分泌系统的所有强制和附加基因，如gldK、gldL、gldM、gldN、porV、sprA、sprE、sprT和gldJ、porU、porQ等。
T9SS底物是含有C-末端域的细胞关联蛋白质，参与毒力、细菌细胞滑动运动和复杂生物聚合物的降解。在T9SS的预测底物中，菌株KMM 9724T和KMM 9713拥有一套内切酶、S8和M1肽酶、重复溶素、粘附蛋白、Cu结合蛋白等Por_Secre_tail含蛋白。这可能意味着这些菌株能够作为一种特定的代谢策略消耗楚科奇海底沉积物中的复杂生物聚合物。
基因组中鉴定的另一个分泌系统是第I型分泌系统，它在革兰氏阴性细菌中广泛存在。它能够在两个膜之间进行底物的一步分泌，不需要任何过渡到胞质外空间的过渡。KMM 9724T和KMM 9713的基因组编码了每个强制基因abc、mfp和omf的两到五个拷贝。
表型特征和化学分类
KMM 9713和KMM 9724T菌株被观察到为革兰氏阴性、好氧性、过氧化氢酶和氧化酶阳性、非运动性。在MA 2216培养基上形成直径为1-3毫米、边缘规则的黄色菌落。电子显微镜图像显示细胞呈卵圆形或杆状形态。细胞尺寸为宽度0.5-0.75微米，长度1.2-3.5微米。细胞周围可能有胶囊材料产生。
新的菌株需要钠离子来生长，在0.5-5%的盐度范围内生长，在7°C和42°C的温度下生长。新的细菌无法水解广泛的多聚底物，并在API 32GN、API 20E和API 20NE测试中无法吸收大多数碳源。新菌株的文化、生理和生化特征和属和种的描述。
KMM 9724T和KMM 9713菌株含有主要的MK-6甲基喹酮，少量MK-5甲基喹酮和微量MK-4甲基喹酮。主要脂肪酸发现为iso-C17:0 3-OH，然后是iso-C15:0，其次是iso-C17:1ω6。MK-6和iso-C17:0 3-OH，iso-C15:0的优势是Weeksellaceae科的成员特有的。
KMM 9724T和KMM 9713菌株的脂肪酸谱与相关的O. rhinotracheale和Empedobacter菌株在大部分iso-C15:0和iso-C17:0 3-OH中是相似的，而O. rhinotracheale菌株则含有大量的iso-C15:0和iso-C17:0 3-OH。
细菌KMM 9713和KMM 9724T在anteiso-C15:0、anteiso-C15:0 3-OH和anteiso-C17:0 3-OH的含量上有所不同，这些在相关的O. rhinotracheale和Empedobacter菌株中没有检测到。此外，Empedobacter的脂肪酸谱中仅出现了总和C16:1ω7c/C16:1ω6c。
新菌株的极性脂质由磷脂酰乙醇胺、一种未知的氨基磷脂、两种未知的氨基脂和两种未知的脂质组成。KMM 9713菌株还包含一种未知的脂质。KMM 9724T和KMM 9713菌株的极性脂质组成与O. rhinotracheale、Empedobacter和Weeksellaceae科的其他报道的组分相似，主要成分是PE。
根据菌株KMM 9713和KMM 9724T的整个基因组序列计算得出的DNA G+C含量为34.5-34.7%。这些值落在Weeksellaceae科成员的DNA G+C范围内，接近Empedobacter成员的DNA G+C平均值，但低于O. rhinotracheale的DNA G+C平均值。
基于16S rRNA基因和整个基因组序列的系统发育关系，以及根据ANI和dDDH分析显示的遗传差异，叠加上菌株KMM 9713和KMM 9724T在生长温度和盐度范围、酶活性和底物水解方面的表型差异，支持了这些新分离株的表型差异。基于综合的系统发育证据、表型和生化特征，建议将菌株KMM 9713和KMM 9724T分类为一个新属新种，即Profundicola chukchiensis gen. nov., sp. nov.，以KMM 9724T型菌株作为模式种。
结论
除了属描述中给出的特性外，该种的特点如下：细胞为卵圆形或杆状，宽度0.5-0.75微米，长度1.2-3.5微米。可以观察到胶囊材料。非运动。在MA 2216培养基上形成直径为1-3毫米的黄色平滑菌落，边缘规则。氧化酶和过氧化氢酶阳性。需要氯化钠来生长。在0.5-5%NaCl存在下生长和在7-42°C下生长。生长的pH范围为5.5-10.5。
主要甲基喹酮是MK-6。主要脂肪酸是iso-C17:0 3-OH，然后是iso-C15:0，其次是iso-C17:1ω6。极性脂质由磷脂酰乙醇胺、一种未知的氨基磷脂、两种未知的氨基脂和两种或三种未知的脂质组成。从基因组序列计算得出的DNA G+C含量为34.5-34.7%。
Profundicola chukchiensis gen. nov. sp. nov.的模式菌株是KMM 9724T。从俄罗斯北冰洋楚科奇海的海底沉积物中分离获得。菌株KMM 9724T和KMM 9713的16S rRNA基因和整个基因组shotgun序列的DDBJ/ENA/GenBank访问号分别为OP604014和LC379507，以及JANAIE010000000.1和JANCMU010000000.1。
参考文献
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