揭示补充维生素B2，对肉鸡微生物群和代谢组的影响

文 |2号生活馆

编辑 |2号生活馆

引言

微生物群和代谢在肉鸡的生长和健康中起着关键作用，维生素B2，也称为核黄素，是一种重要的水溶性维生素，对动物的生长和代谢具有重要影响，本文研究的目的是通过采用分子生物学和代谢组学等方法，我们旨在了解维生素B2补充是否能够改变肉鸡肠道微生物群的组成，以及是否对肉鸡的代谢产物产生影响。

研究表明，维生素B2的补充可能导致肉鸡肠道微生物群的变化，特定的细菌群落可能会显著增加或减少，从而影响整体的微生物生态系统，并且维生素B2的补充可能导致肉鸡体内代谢产物的变化，代谢产物谱可能显示出某些代谢途径的激活或抑制，从而影响肉鸡的能量代谢和生长。

实验设计与采样

实验使用了三组每组120只Ross 308母鸡，它们被放置在家禽研究机构，分成三个独立的房间，分别标记为A、B和C，这些房间彼此相邻，环境条件相同，每个房间的鸟类接受不同的饮食，分别是：房间A是对照饮食；房间B是控制饮食 + 50毫克/千克维生素B2；房间C是对照饮食 + 100毫克/千克维生素B2。

每个房间进一步分成三个不同的围栏，每个围栏中有40只鸟，对照日粮的组成见表S1，为了获得中等和高水平维生素B2的摄入量，对照日粮中含有标准剂量维生素B2，以符合肉鸡生长阶段的建议。

然后分别在B组添加了50毫克/千克和C组添加了100毫克/千克的维生素B2，为了确保足够的维生素B2进入下肠道，设定了B组和C组的剂量分别为对照组的10倍和20倍，根据ISO EN 2：14152标准，使用HPLC检测了提供给动物的饲料中维生素B2的最终含量。

每个实验组在第15天、第28天和第42天进行了三次采样，在每个采样期间，随机选择每个房间中的总共40只鸟，并按照道德准则进行安乐死，以减少压力和痛苦，此外，还收集了10个垫料样本，每个样本重量为3克。

从每只鸟身上取得整个胃肠道，将盲肠和回肠内容物收集在80毫升的无菌管中，然后在液氮中迅速冷冻并储存在-120°C，以备进一步研究之用，对<>只鸟类的盲肠内容物进行了采集，每个样本均制备了两份，分别用于微生物组和NMR代谢组的分析。

所有DNA样品都经过相同的扩增和测序处理，与之前报道的方法相同，使用带有Illumina标签的3F和4R引物对16S rRNA基因的V341-V785高变区进行了PCR扩增，扩增产物经过AMPure XP磁珠纯化处理，为制备索引文库，使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒进行处理，进行了进一步的磁珠纯化。

然后使用Qubit 3.0荧光计对文库进行定量，并将其聚集至4 nM，使用0.2 N NaOH对文库池进行变性，并稀释至6 pM，按照制造商的说明，使用2×250 bp配对协议在Illumina MiSeq平台上进行了测序，为了确保对所有样品的适当测序深度，进行了三次Illumina测序，在混合的盲肠和回肠样品以及来自不同组的样品时要特别小心。

微生物群落测定

这个试验的目的是评估补充维生素B2对肉鸡回肠、盲肠和垫料微生物群的影响，以及对盲肠内容物的代谢特征的影响，因此，饲养的鸟类数量不适合计算生产绩效指标，然而，在每个采样时间点，还评估了每组鸟类的平均体重，以与与鸟类年龄相关的预期值进行比较。

在试验中，共分析了357个样品，包括357个盲肠样品、27个回肠样品和120个垫料样品，对于盲肠和回肠，第一个时间点有119个样本，第二个时间点有118个样本，第三个时间点有4个样本，总共获得了986、865和1099个高质量的序列，序列数在15至182,649之间。

平均每个样品为2715±644,889个序列，这些测序读数已存档在SRA-NCBI中，这些读数经过处理，聚类为950,12个扩增子序列变体，β多样性分析显示，基于加权和未加权Unifrac距离，回肠和盲肠微生物群落之间存在明显分离，而垫料样品位于两个肠隔室之间。

根据之前的文献，盲肠微生物群主要由瘤胃球菌科和螺旋菌科组成，而回肠样品中乳杆菌科是主要优势科，与此相反，垫料样品显示出不明显的优势系统发育特征，属于变形杆菌门和放线菌门的科在其中显示出高丰度和多样性。

因此，相对于盲肠和回肠样品，垫料样品显示出更高的生物多样性，无论是通过Faith's PD指标还是ASV丰富度来衡量，关于香农多样性指数，垫料和盲肠样品显示相似的值，均高于回肠样品的值。

对于可用的盲肠样品进行的β多样性分析表明，从B组中获取的样品在微生物群结构方面与A组和C组显示出不同的纵向变化轨迹，通过加权Unifrac距离绘制整个样本集，使用未加权的UniFrac距离获得的PCoA显示不同组之间的重叠更多，这表明B组肉鸡微生物群的差异主要存在于丰富的细菌物种中，而不是优势细菌物种。

在回肠样本中，β多样性分析未显示A组、B组和C组之间的明显分离，对于垫料样本，基于加权和未加权Unifrac距离的PCoA描述显示，从C组中获取的样品与其他两组略有分离，但这需要在较大的样本上进一步探索。

家庭水平的成分分析强调，补充维生素B2促进了盲肠中拟杆菌科的逐渐增加，而在A组和C组中，盲肠中的拟杆菌门主要由属于Rikenellaceae家族的细菌组成，这一观察结果在科和属水平得到了证实，事实上，拟杆菌科和拟杆菌属在所有可用的时间点上在B组中显示出显著更高的丰度。

相反，Rikenellaceae家族，特别是其Alistipes属在A组和C组中在T3时显示出更高的丰度，然而，C组肉鸡盲肠的平均家庭水平概况显示双歧杆菌科的丰度在T1到T3逐渐增加，而在A组和B组中没有观察到这种变化。

这种差异在属水平上也得到了证实，在盲肠样本的属水平分析中，B组和C组的维生素B2补充加速了瘤胃球菌科的相对丰度增加，B组和C组在T1显著高于对照组A，这反映了瘤胃球菌科和粪杆菌属的类似增加，在后续时间点，三组中瘤胃球菌科和/或粪杆菌科的相对丰度没有显著差异。

生态学视角解析微生物群

随后，使用不同的OTU选择策略对序列进行了重新分析，以便更好地解释在三个生态系统中最常见和最持久的细菌群的生态行为，并评估维生素B2补充在生态水平上的影响，使用97%的相似性阈值允许我们获得一些序列组。

这些组可能归因于一小群物种，这些物种在盲肠、回肠和垫料的微生物生态系统内和之间可能具有特定的生态行为，在获得的这些97%相似性的OTU中，我们过滤掉了至少在一个时间点中相对丰度大于1.90%的样品中少于1.90%的OTU，从而定义了生态系统特定的“核心微生物群”。

对于这些“核心97%相似性OTU”，我们计算了每个OTU在相对丰度大于0.1%的情况下检测到的样品百分比，并使用热图来显示这些信息，通过观察不同样本中每个OTU的存在率，我们将核心OTU分为九组。

G1组包括在纵向采样中持续存在于盲肠中的核心细菌，其中包括被归类为健康促进的粪杆菌的OTU，补充维生素B2似乎不影响这些细菌在盲肠中的存在率，但在回肠中似乎有影响。

G2组包括归属于乳酸杆菌属的OTU，这些细菌是回肠核心微生物群的持续组成部分，这验证了之前的文献，但这些细菌也经常从垫料和盲肠中检测到。

G3组包括梭状芽孢杆菌、肠球菌和乳酸杆菌的OTU，它们只在某一或两个时间点中是回肠核心微生物群的一部分，有时也会从盲肠中检测到，补充维生素B2似乎影响了这些细菌在回肠中的存在率。

G4组仅包括一个属于消化链球菌科的97%相似性的序列，被归类到Ramboutsia属，这是对照组T3中核心回肠和盲肠微生物群的一部分，但在B组和C组中不太普遍，这个分类单元可能解释了为什么在B组和C组中消化链球菌科回肠相对丰度显著降低。

G5组包括至少在一个时间点中是盲肠核心微生物群的一部分的厚壁菌成员，它们有时会污染回肠和垫料样本，且似乎独立于维生素B2补充而保持这种生态行为，其中一些OTU被归类到以丁酸盐或乙酸盐生产能力而闻名的属，例如亚粒状芽孢子虫、丁酸球菌、阿加索巴库鲁姆、Kineothrix和厌氧菌，以及Blautia和Faecalimonas等乙酸盐生产能力属。

G6组包括盲肠微生物群的非厚壁菌OTU，这些细菌在受维生素B2补充剂影响时的存在率受到了严重影响。

G7组仅包括一个归属于肠杆菌科的OTU，该OTU始终在垫料中定植，但也包括盲肠和回肠。

最后两组OTU，G8和G9，包括广泛定植于环境中的细菌，G8组的OTU在偶尔从回肠样本中检测到，可能是通过肉鸡的垫料摄入而进入，值得注意的是，在接受最高维生素B2剂量的肉鸡中，G9 OTU的持续存在率和存在的样品百分比较低，这可能解释了使用未加权的Unifrac距离进行的β多样性分析中观察到的轻微分离。